隨著CRISPR-Cas技術的問世，人類改造、編輯生物基因密碼的腳步大大加快。有了這把趁手的“基因魔剪”，人類可以對基因進行高效地定點編輯。

然而，主流的Cas9和Cas12a酶似乎更擅長單個堿基的定點編輯，在進行大規模刪除DNA的時候顯得“力不從心”。不過10月19日，美國研究人員在《自然·方法》發表論文稱，他們開發出一種緊湊型級聯CRISPR-Cas3系統，可快速準確地對大規模DNA片段進行刪除。

傳統“魔剪”只能“剪”小片段DNA

CRISPR-Cas系統的類型眾多，目前研究最深入應用最成熟的就是CRISPR-Cas9系統。CRISPR-Cas9的結構簡單，能夠很容易地進入任何細胞，并精確地作用于DNA。只需要用目標遺傳密碼序列對它進行編程，這一工具便能夠掃描整個DNA鏈，找到對應部分的基因，在適當的位置將這段DNA“剪”開。

“CRISPR-Cas9系統非常適合在明確或者校正某一個基因功能突變的時候，對單個基因進行剪輯或者小片段進行修改。”南開大學生命科學學院副院長陳凌懿教授介紹，雖然Cas9可以在需要的地方進行剪切，但是只能剪一刀，因此想刪除整個基因位點特別大的DNA片段時，就存在一定局限性。

“就像拆遷房子，如果小區里只有一幢危樓，那么只需要對這幢危樓進行維修或者拆除重建;但是如果要平整土地，或者拆除修補危樓的時候，那就要拆除更多的房子，破壞整個小區環境了。”陳凌懿說，拆遷一幢樓不可能大刀闊斧，但是拆遷很多房子就需要更高效的工具了。

陳凌懿進一步解釋說：“最近發現，Cas9產生的‘基因敲除’，通常通過在編碼基因的開放閱讀框中引入小的插入或刪除突變而導致移碼突變，這種方法適用于編碼蛋白質的mRNA(信使RNA)。移碼突變是指，3個核苷酸密碼編碼一個氨基酸，當刪除的核苷酸數不是3的整數倍時，就會導致編碼順序發生錯位而出現的突變。然而，對非編碼RNA，因為其并不編碼蛋白質，所以不存在移碼突變。此時，就需要采取全基因去除的方法。而哺乳動物的基因，一個基因可能很大，包括外顯子和內含子，當幾個外顯子相距比較遠的時候，如果想完整刪除，就需要刪除很大片段DNA。”

對于真核細胞來說，可大片段刪除DNA的工具將促進對大部分非編碼基因片段的詢問，提高對大部分未知功能的編輯效率，它因此將成為一個強大的基因篩選工具。

升級版能“吃掉”大片段DNA

作為“基因魔剪”的CRISPR系統是如何工作的呢?

陳凌懿介紹，CRISPR系統主要由相關核酸酶(Cas9)和向導RNA(gRNA)組成。gRNA能識別出外來侵略者的特定核酸序列，在堿基配對成功后，Cas9蛋白會使識別位點的DNA雙鏈斷裂。隨后生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，大多數時候這種連接會引入片段或刪除突變，從而實現了細胞中目標基因的敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的“模板”(供體DNA分子)，這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變，以此實現基因的替換或者突變。

此次“升級版”新系統，稱為 CRISPR-Cas3系統，是由進行性核酸酶Cas3和其他成分組成的最小版本。該Cas3系統可用來切斷DNA片段，刪除長段DNA。而且它的精度很高，是少有的高質量大規模編輯工具。Cas3系統只需要4個蛋白和1個crRNA，CRISPR-Cas9系統卻需要6個蛋白和1個crRNA，而在基因編輯時，需要將此系統導入到目標細胞中，系統越小，越容易操作。Cas3作為最小的CRISPR系統的一部分，兼具準確性和可變性，已在銅綠假單胞菌中高效地完成了堿基對數量高達424kb的基因組刪除。

“與Cas9剪一刀就完成任務不同，Cas3系統不僅像一把剪刀，還像‘吃豆人’游戲里的‘大嘴巴’。”陳凌懿介紹，Cas3系統找到特定的DNA靶標后，可以先像Cas9一樣剪斷DNA雙鏈，但是和Cas9不同，Cas3將停留在DNA斷點處繼續吞食DNA，很快就能“吃掉”一大段，最終造成大片段DNA的刪除。

“之所以可以變身‘吃豆人’，與Cas3的DNA酶特性有關，其亞單位比Cas9多一些，有結構可以結合到DNA上。”陳凌懿解釋說，就相當于只有抓住繩子末端，才可以沿著繩子往前走。雖然Cas3和Cas9識別DNA特異序列的方式是一樣的，但是識別之后，剪切的方式是不一樣的。Cas3系統既有手的功能，能錨定在DNA的位點上，同時又有“吃豆人”的功能，不斷把DNA“吃”下去。

未來在工業發酵領域應用價值大

CRISPR系統目前主要應用于腫瘤、遺傳等疾病的治療方面。此次CRISPR-Cas3系統的出現，其高效率和高精度是否能讓CRISPR系統的應用更加廣闊?

“在CRISPR-Cas9系統中存在的脫靶效應，在大片段刪除系統中同樣存在這樣的風險。而且大片段刪除還增加另一個風險，就是可否準確地控制刪除的長度。”陳凌懿對CRISPR-Cas3系統刪除基因的精準性提出了質疑。科學家在實驗室可以篩選出準確刪除目標基因的細胞;但是在臨床應用中，可能會面臨更多的問題和挑戰。另外，目前的工作只證明了CRISPR-Cas3系統在細菌中起作用，能否在高等生物特別是哺乳動物中應用CRISPR-Cas3系統進行大片段DNA的刪除，還有待證明。

“此外，在臨床上，患者進行治療時，我們檢測到某一個基因突變了，要定點把突變基因修復，這需要進行精準編輯。”陳凌懿認為，如果大片段刪除基因，就是一種大規模的破壞性治療，不符合臨床小規模、小修復的治療原則，這種案例非常少見。而且以目前我們對編碼或是非編碼基因的了解，大片段刪除或引入還有很多未知數，因此很可能病沒治好，反而增添了新病。

“雖然說目前應用于臨床還有一定難度，但CRISPR-Cas3還可以在工業、農業中發揮作用。”陳凌懿表示，比如工業發酵，所使用的菌種基因組越大，整個發酵過程中真正合成目標產物就越低效。“因此在進行工業發酵的時候，我們選擇菌種希望越簡單越好，除了菌種存活所必需的基因外，最好就一個酶。”陳凌懿說，把系統簡化的時候相當于把菌種里不需要的基因去掉，在最小基因組的細菌當中，引入新的基因。這種做減法的過程就可以使用CRISPR-Cas3系統進行大片段刪除來完成。如果DNA刪多了，菌種可能就死掉了，只有刪得合適了，才能得到基因組被簡化的活菌種。(陳 曦)